凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)的操作方法介紹

　　一、凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)定義

　　凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)（gelreiardadonassay，又稱為mobthtyshiftassay）方法簡(jiǎn)單、靈敏，可以定量的特性使它在研究轉(zhuǎn)錄和基因調(diào)控中廣泛的應(yīng)用。目前通常用于RNA(或DNA)結(jié)合蛋白的純化，確定一種已知或可能的RNA結(jié)合蛋白所識(shí)別的序列，建立反應(yīng)常數(shù)（如親和常數(shù)和解離常數(shù)）等。

　　二、操作方法

　　1.RNA和蛋白的結(jié)合反應(yīng)

　　(1)冰浴，微量離心管中加入下列試劑，并混勻：末端標(biāo)記的RNA片段1ng，10X結(jié)合緩沖液2μl，末標(biāo)記的同種RNA適量，待測(cè)蛋白適量，加水至20μl。

　　(2)37°C溫育反應(yīng)液30min，溫度和時(shí)間需要通過(guò)經(jīng)驗(yàn)確定，對(duì)于大多數(shù)反應(yīng)，30min足夠達(dá)到平衡。

　　2.非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳

　　(1)凝膠可以提前制備。用水和乙醇*淸洗玻璃板，使用0.7mm薄墊片，12齒梳子，每齒的尺寸為0.8cmX1.5cm，玻璃板的尺寸為18cmX23cm。

　　(2)混合適當(dāng)?shù)膬?chǔ)存液得到40ml的溶液，含有6%丙烯酰胺、0.12%甲叉雙丙烯酰胺、25mmol/LTris堿，0.2mol/L甘氨酸、5%甘油，加入15mg過(guò)硫酸銨和TEMED，灌注到兩玻璃板之間，插入梳子，深度為1~1.2cm，等到*聚合，在最后的電泳溫度平衡凝膠。

　　(3)去掉底部的墊片，將凝膠裝到電泳槽，在頂部和底部槽中加入電泳緩沖液（25mmol/LTris堿和0.2mol/L甘氨酸），用吸管吹打毎個(gè)孔確保孔中的凝膠底部任何空間的氣泡被去除，在上樣以前300V預(yù)電泳凝膠不少于30min。

　　(4)上樣，300V電泳3h。

　　(5)倒空電泳槽，取下凝膠。所有的放射性物質(zhì)，包括RNA標(biāo)記反應(yīng)時(shí)未結(jié)合的核苷三磷酸仍然留在凝膠中，底部槽中的緩沖液應(yīng)該沒(méi)有放射性，但是任何試驗(yàn)參數(shù)發(fā)生了改變，必須測(cè)定底部糟中的緩沖液有沒(méi)有放射性（在任何情況下此操作都很有必要）。去掉一個(gè)玻璃板，依據(jù)定量的方法不同，凝膠可以置于Whatman濾紙上在凝膠干燥器中干燥，固定（12%甲醇，10%的乙酸）或直接用塑料膜包裹濕的凝膠直接進(jìn)行定量。