2023年2月9日，浙江大學農業與生物技術學院的最新研究成果，發表在Molecular Plant期刊上(影響因子21.949)，文章題目為“Single-cell transcriptomic analysis reveals the developmental trajectory and transcriptional regulatory networks of pigment glands in Gossypium bickii"。該研究使用DNA親和純化測序(DAP-seq)技術鑒定了比克氏棉子葉GoPGF的結合基序和下游靶基因。并進一步揭示了比克氏棉色素腺形態建成的調控網絡，為培育具有特定性狀的栽培棉花新品種提供了寶貴的基因資源。
從萌發的比克氏棉子葉中分離原生質體，進行單細胞RNA測序（scRNA-seq），保留了12222個單細胞轉錄組數據用于下游分析。聚類為14個不同的細胞簇，這些細胞在已知的細胞標記基因的輔助下被分為8個細胞類群，包括：葉肉細胞(MC)、色素腺細胞(PG)、表皮細胞(EC)、保衛細胞(GC)、木質部細胞(XC)、原形成層細胞(PC)、韌皮部薄壁細胞(PP)和伴胞(CC)。色素腺細胞群與其他細胞群的分離效果良好，并進一步分為色素腺薄壁細胞、分泌細胞和凋亡細胞。隨后，通過分析3種色素腺細胞的連續分化軌跡，初步闡明了色素腺的發育模式。
圖1. 棉花子葉單細胞轉錄圖譜的構建
轉錄因子是植物所有生物過程的關鍵調控因子，包括色素腺的形成。在色素腺細胞中鑒定的轉錄因子，大多數與色素腺薄壁細胞的分化有關，包括bHLH、AP2/ERF、C2H2、GRAS、NAC和WRKY。從薄壁細胞向分泌細胞的轉變受AP2/ERFs和WRKYs的調控，而從分泌細胞向凋亡細胞的轉變受MYBs的調控。GoPGF是一種bHLH轉錄因子，已被證明在色素腺薄壁細胞起始中發揮重要作用，但調控色素腺形態發生的轉錄調控網絡仍不清楚。采用DAP-seq分析對GoPGF下游靶基因進行鑒定，并通過整合DAP-seq和scRNA-seq的結果，構建了一個以GoPGF為hub基因的轉錄調控網絡。
圖2. 調節色素腺細胞發育的轉錄因子網絡
接下來，利用病毒介導的基因沉默系統對8個與色素腺形成相關的轉錄因子進行基因沉默，其中包括3個新基因GbiERF114（AP2/ERF），GbiZAT11（C2H2）和GbiNTL9（NAC），以及5個已知的同源基因GbiCGF1(bHLH)，GbiGoPGF(bHLH)，GbiGoSPGF(GRAS)，GbiCGP1(MYB)和GbiCGF2(NAC)，這些基因的沉默顯著影響幼苗葉片和莖中色素腺的發育及其棉酚含量。因此，這些類型的轉錄因子可能在棉花色素腺的形成中起重要作用。通過功能富集分析、順式調節元件分析，還發現光和赤霉素可以促進色素腺的形成。
圖3. 轉錄因子在色素腺發育中的功能驗證
小結：該研究整合了色素腺細胞的發育軌跡、轉錄因子調控網絡和核心轉錄因子的功能驗證，提出了一個相對完整的色素腺形態建成模型。同時，解析了GoPGF和其他轉錄因子在色素腺形成中的作用機制。此外，還發現了3個與色素腺體形成相關的功能基因（GbiERF114、GbiZAT11、GbiNTL9）以及光和赤霉素促進色素腺形成這一現象。這些發現為棉花色素腺的形態建成提供了新的見解，為栽培棉花新品種培育提供了珍貴的基因資源。
藍景科信提供了DAP-seq技術支持。
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