DNA pull down技術(shù)助力揭示AP2/ERF類轉(zhuǎn)錄因子提高芍藥耐高溫能力的分子機制

芍藥是一種傳統(tǒng)的中藥材，并且具有欣賞價值，其生長發(fā)育經(jīng)常受到高溫脅迫的影響。褪黑素是一種內(nèi)源性微分子吲哚胺化合物，在各種生物體中具有多種生理功能，大量研究表明調(diào)節(jié)與褪黑素生物合成相關(guān)的基因來提高植物對高溫的耐受性。之前的研究中PlTDC被確定為P. lactiflora中褪黑素生物合成的關(guān)鍵基因。然而，關(guān)于內(nèi)源性褪黑素與P. lactiflora耐高溫之間的關(guān)系以及潛在的遺傳機制的更深入的研究尚未報道。

2022年5月19日，揚州大學園藝與植物保護學院陶俊和趙大球教授團隊共同在Plant, Cell & Environment（IF=7.79）雜志上發(fā)表了題為“Herbaceous peony AP2/ERF transcription factor binds the promoter of the tryptophan decarboxylase gene to enhance high-temperature stress tolerance"的研究性論文。

在本研究中提到，PlTDC在P. lactiflora耐高溫脅迫中發(fā)揮了積極作用，并通過DNA pull-down技術(shù)鑒定了其表達受到AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子PlTOE3的激活，增強了褪黑激素的產(chǎn)生和高溫耐受性。這些結(jié)果為研究植物高溫脅迫的調(diào)控機制提供了新的思路。

圖1.芍藥中PlTDC和褪黑素含量的表達

1.PlTDC轉(zhuǎn)錄響應高溫脅迫

為了分析PlTDC是否對高溫脅迫有響應，首先通過qRT-PCR檢測了高溫脅迫下P. lactiflora葉片中PlTDC的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果表明，高溫脅迫誘導PlTDC轉(zhuǎn)錄。

圖2.高溫脅迫對過表達PlTDC的野生型和轉(zhuǎn)基因煙草系的影響

2.煙草中PlTDC的異源過表達提高了煙草對高溫脅迫的抗性

為了證實PlTDC在調(diào)節(jié)煙草耐高溫性中的作用，在煙草中異種過表達PlTDC。將WT植株和轉(zhuǎn)基因株系在42°C下脅迫72 h。WT植株全部枯萎，而轉(zhuǎn)基因株系生長正常。此外，DAB染色顯示轉(zhuǎn)基因株系中H2O2含量明顯低于WT植株。高溫脅迫下轉(zhuǎn)基因品系的REC和MDA含量顯著低于WT植株，而Fv/Fm顯著高于WT植株。同時檢測相關(guān)保護酶基因的表達水平。Cu/ZnSOD、過氧化物酶基因(POD)和*酶基因(CAT)，在高溫脅迫下在轉(zhuǎn)基因系中顯著高表達。結(jié)果顯示，過表達PlTDC可以通過增加褪黑素的產(chǎn)生來提高煙草對高溫脅迫的抵抗力。

圖3.高溫脅迫對野生型和PlTDC沉默型植物的影響

3.沉默PlTDC可增加P. lactiflora對高溫脅迫的敏感性

為了進一步研究PlTDC在P. lactiflora耐高溫中的作用，利用VIGS技術(shù)抑制了P. lactiflora中PlTDC的轉(zhuǎn)錄。qRT - PCR結(jié)果顯示，PlTDC沉默植物的轉(zhuǎn)錄物水平僅為WT植物的21.56%，褪黑素含量也相應降低。WT、pTRV2空載體轉(zhuǎn)化和PlTDC沉默的植株高溫脅迫，PlTDC沉默植株的生長與對照相比受到明顯抑制。此外，與WT相比，PlTDC沉默植株的H2O2積累顯著， REC和MDA含量增加，F(xiàn)v/Fm和保護酶活性(SOD, POD和CAT)降低，在高溫脅迫下，這些指標之間存在顯著差異。這些結(jié)果證實了PlTDC通過調(diào)節(jié)褪黑激素的產(chǎn)生參與P. lactiflora高溫應激反應的功能。

圖4.PlTOE3序列分析

圖5.PlTOE3激活了PlTDC的啟動子活性

4.PlTOE3特異性激活PlTDC啟動子

之后為確定上游調(diào)控區(qū)域?qū)Ω邷卣T導PlTDC表達的重要性，克隆了其上游2402bp的啟動子片段，隨后，上游調(diào)控PlTDC的轉(zhuǎn)錄因子采用DNA pull down實驗進行篩選。DNA Pull Down使用特殊標記的DNA探針作為誘餌，與提取的內(nèi)源細胞核蛋白進行孵育，捕獲與DNA探針特異性結(jié)合的蛋白，最終使用蛋白質(zhì)譜的方法，鑒定出特異性結(jié)合的蛋白。結(jié)果顯示，僅獲得1個乙烯響應元件結(jié)合因子(AP2/ERF)轉(zhuǎn)錄因子。該轉(zhuǎn)錄因子接近擬南芥TOE3蛋白，聚集在AP2亞家族中，之后將這個序列命名為PlTOE3。

為確定PlTOE3是否與PlTDC啟動子特異性結(jié)合，進行了酵母單雜交Y1H和熒光素酶互補實驗LRA進行驗證。Y1H實驗表明，PlTOE3可以與PlTDC啟動子相互作用。LAR證實，PlTOE3激活了煙葉中的PlTDC啟動子。

圖6.PlTOE3的表達和亞細胞定位

5.PlTOE3轉(zhuǎn)錄對高溫脅迫的響應

為了分析PlTOE3是否也對高溫脅迫有響應，檢測了高溫脅迫下葉片中PlTOE3的轉(zhuǎn)錄水平。PlTOE3的轉(zhuǎn)錄水平在P. lactiflora發(fā)育過程中隨著溫度的逐漸升高而升高，并隨著高溫脅迫時間的延長呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。這表明，PlTOE3與PlTDC具有相同的表達模式，意味著PlTOE3可能積極參與調(diào)控高溫抗性。此外，表達PlTOE3‐GFP融合蛋白的煙葉在細胞核中顯示出強烈的信號，表明PlTOE3是一個核定位蛋白，這與上述NLS序列的結(jié)果一致。

圖7.高溫脅迫對過表達PlTOE3的野生型和轉(zhuǎn)基因煙草系的影響。

圖8.高溫脅迫對野生型和PlTOE3沉默型植物的影響

6.PlTOE3正調(diào)控對高溫脅迫的抗性

將PlTOE3在煙草中過表達，轉(zhuǎn)基因株系中煙葉NtTDC1的轉(zhuǎn)錄本水平比WT植株高17倍以上。在42°C高溫脅迫72 h后，轉(zhuǎn)基因植株生長正常，與WT植株相比，ROS積累、REC和MDA含量顯著降低;相比之下，F(xiàn)v/Fm和保護酶基因(Cu/ZnSOD、POD和CAT)表達水平顯著升高。利用VIGS技術(shù)在P. lactiflora中沉默PlTOE3， PlTOE3和PlTDC的轉(zhuǎn)錄水平分別被抑制后，褪黑素含量、ROS、REC和MDA含量增加，F(xiàn)v/Fm和保護酶活性(SOD, POD和CAT)降低。上述結(jié)果與PlTDC轉(zhuǎn)基因結(jié)果一致，表明PlTOE3正調(diào)控了高溫脅迫抗性。

圖9.PlTOE3調(diào)控芍藥耐高溫脅迫的模型

小結(jié)

高溫誘導了PlTOE3的表達，這是一種核定位蛋白。這些結(jié)果與先前的研究一致。然而，很少有研究關(guān)注TOE3在高溫脅迫耐受中的作用;在本研究中證明了P. lactiflora中AP2/ ERF轉(zhuǎn)錄因子PlTOE3靶向PlTDC啟動子，這是增加褪黑素產(chǎn)生的關(guān)鍵因素。褪黑素不僅作為一種抗氧化劑直接消除活性氧還作為一個信號來激活SOD-CAT途徑消除ROS，最終增強P. lactiflora的高溫脅迫耐受性。

DNA Pull Down技術(shù)簡介

DNA Pull Down是一種新穎的DNA-蛋白互作技術(shù)，能夠鑒定與特定DNA序列結(jié)合的蛋白（轉(zhuǎn)錄因子或者DNA結(jié)合蛋白）。DNA Pull Down使用特殊標記的DNA探針作為誘餌，與提取的內(nèi)源細胞核蛋白進行孵育，捕獲與DNA探針特異性結(jié)合的蛋白（比如轉(zhuǎn)錄因子），最終使用蛋白質(zhì)譜的方法，鑒定出特異性結(jié)合的蛋白。DNA Pull Down的優(yōu)勢在于，探針的設計長度范圍廣，蛋白保持天然結(jié)構(gòu)，實驗周期短，通量高，特異性強，假陽性率低，應用范圍廣（適用于原核生物與真核生物）。將DNA Pull Down與蛋白質(zhì)譜結(jié)合，又具備高靈敏度的特點。

技術(shù)優(yōu)勢

探針長度設計范圍廣

蛋白提取自新鮮組織和細胞，保持天然構(gòu)象

特異性強，假陽性率低

適用于真核生物和原核生物

實驗周期短，高通量，高靈敏度