DAP-seq助力揭示GhRCD1促進棉花對鎘的耐受調(diào)節(jié)機制

鎘（Cd²⁺）是環(huán)境中最常見的有害重金屬之一，嚴重威脅作物生產(chǎn)力和質(zhì)量以及食品安全。Cd²⁺容易被植物從土壤中吸收，并通過可食用的植物器官和谷物進入食物鏈，對食品質(zhì)量、糧食安全和公共安全構(gòu)成威脅。

植物修復(fù)是減少土壤污染的有效途徑之一。棉花作為一種重要的非食用經(jīng)濟作物，與糧食作物（小麥、水稻和玉米）、油料作物（花生和大豆）和蔬菜（豆類、黃瓜和番茄）相比，在修復(fù)土壤Cd²⁺污染方面具有天然優(yōu)勢，避免了Cd²⁺進入食物鏈的風險。因此，探究棉花響應(yīng)鎘脅迫的調(diào)控機制至關(guān)重要。

2024年1月16日，中國農(nóng)業(yè)科學院棉花研究所李付廣研究員團隊的研究成果，發(fā)表在Plant Biotechnology Journal期刊上（IF=13.8），文章題目是“GhRCD1 promotes cotton tolerance to cadmium by regulating the GhbHLH12-GhMYB44-GhHMA1 transcriptional cascade" 。該研究使用DNA親和純化測序（DAP-seq）等分子相互作用研究方法，發(fā)現(xiàn)了調(diào)節(jié)棉花Cd2+耐受性的分子級聯(lián)反應(yīng)，揭示了GhRCD1通過調(diào)控GhbHLH12-GhMYB44-GhHMA1轉(zhuǎn)錄級聯(lián)通路響應(yīng)鎘脅迫的分子機制，為培育耐鎘棉花新品種和通過植物修復(fù)手段降低鎘污染提供了新思路。

1.突變ghrcd1 基因降低棉花Cd²⁺耐受性

為探究Cd²⁺對棉花毒性的分子機制，作者通過T-DNA插入得到對Cd²⁺敏感的突變體ghrcd1。Cd²⁺處理后，通過表型觀察，RT-qPCR分析，PI染色，葉綠體結(jié)構(gòu)觀察，SPAD分析等實驗發(fā)現(xiàn)，ghrcd1幼苗比WT植株表現(xiàn)出更低的Cd²⁺耐受性，這表明，抑制GhRCD1表達會降低棉花Cd²⁺耐受性，GhRCD1在棉花應(yīng)對鎘脅迫時具有正向調(diào)節(jié)作用。

2.敲除棉花GhRCD1基因，降低棉花Cd²⁺耐受性

為了進一步研究GhRCD1在棉花耐鎘脅迫中的作用，作者構(gòu)建了KO-GhRCD1株系和OE-GhRCD1株系。Cd²⁺處理后，通過表型觀察，PI染色，葉綠體結(jié)構(gòu)觀察，SPAD分析等實驗發(fā)現(xiàn)，與WT相比，KO-GhRCD1的Cd²⁺耐受性更低，OE-GhRCD1的Cd²⁺耐受性更高。這些結(jié)果表明GhRCD1能減弱Cd²⁺對棉花的毒性。

3.GhRCD1與GhbHLH12在體外和體內(nèi)均存在相互作用

作者使用GhRCD1為誘餌蛋白，對棉花應(yīng)激響應(yīng)蛋白庫進行Y2H篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)GhbHLH12轉(zhuǎn)錄因子與GhRCD1存在相互作用。而后通過BiFC、GST pull down和LCI實驗進一步驗證了這一結(jié)果。這些結(jié)果表明GhRCD1與GhbHLH12在體外和體內(nèi)都能與GhbHLH12相互作用。

4.抑制GhbHLH12表達增強棉花Cd²⁺耐受性

為探究GhbHLH12是否參與了棉花應(yīng)對Cd²⁺脅迫的反應(yīng)，作者構(gòu)建了棉花的OE-GhbHLH12株系和GhbHLH1-RNAi株系。Cd²⁺處理后，GhbHLH1-RNAi的Cd²⁺耐受性增加，OE-GhbHLH12的Cd²⁺耐受性降低。為確定GhbHLH12在調(diào)節(jié)Cd²⁺耐受性中是否有基因依賴性，作者敲除GhbHLH12得到KO-GhbHLH12株系，Cd²⁺處理后，KO-GhbHLH12植株比對照植株具有更高的耐受性。這些結(jié)果說明，抑制GhbHLH12表達增強了棉花的Cd²⁺耐受性。

5.GhRCD1減弱GhbHLH12對GhMYB44的轉(zhuǎn)錄抑制作用，提高棉花Cd²⁺耐受性

為探究GhbHLH12抑制棉花Cd²⁺耐受性的機制，作者對WT幼苗進行了RNA-seq和DAP-seq聯(lián)合分析。DAP-seq結(jié)果顯示GhbHLH12在GhMYB44的啟動子區(qū)域有顯著富集，而后，Y1H和EMSA實驗證實了GhbHLH12蛋白和GhMYB44的結(jié)合基序G-box相互作用。LUC/REN報告實驗表明GhbHLH12抑制GhMYB44的轉(zhuǎn)錄，而GhRCD1可以減弱GhbHLH12對GhMYB44的抑制作用，EMSA結(jié)果也表明GhRCD1減弱了GhbHLH12與GhMYB44的結(jié)合，結(jié)合RT-qPCR實驗結(jié)果，說明GhRCD1和GhbHLH12分別是Cd²⁺耐受性的正負調(diào)節(jié)因子，并且在Cd²⁺脅迫下，轉(zhuǎn)錄調(diào)控存在復(fù)雜的相互作用。

6.GhMYB44表達增強棉花Cd²⁺耐受性

為探究GhMYB44響應(yīng)Cd²⁺脅迫的機制，作者構(gòu)建了GhMYB44-OE1/5株系和GhMYB44-SRDX1/6株系。Cd²⁺處理后，與WT相比，GhMYB44-OE表現(xiàn)出更高的Cd²⁺耐受性，而SRDX-GhMYB44-1/6植株表現(xiàn)出更低的耐受性。這表明GhMYB44表達增強了棉花的Cd²⁺耐受性。隨后作者采用VIGS技術(shù)沉默對照和KO-GhbHLH12株系中的GhMYB44基因，結(jié)果表明GhMYB44在GhbHLH12的下游發(fā)揮作用。

7.棉花應(yīng)對Cd²⁺脅迫的GhMYB44–GhHMAs轉(zhuǎn)錄級聯(lián)反應(yīng)

為探究棉花中GhMYB44提高Cd²⁺耐受性的作用機制，作者利用DAP-seq技術(shù)找到GhMYB44的10207個潛在結(jié)合位點，其中61.42％位于基因間區(qū)，22.31％位于啟動子區(qū)。GO分析顯示，靶基因顯著富集在脅迫應(yīng)答（GhWRKY13和GhWRKY51）和金屬離子結(jié)合和運輸（GhHMA1、GhHMA2和GhHMA5）通路。為研究GhMYB44是否通過GhHMA1和GhHMA5在Cd²⁺轉(zhuǎn)運中發(fā)揮調(diào)控作用，作者通過Y1H、EMSA實驗驗證了GhMYB44特異性結(jié)合GhHMA１和GhHMA5的G-box（CATGTG）順式作用元件。LUC/REN報告實驗結(jié)果表明，GhMYB44可以直接激活GhHMA1和GhHMA5的轉(zhuǎn)錄來調(diào)控Cd²⁺的轉(zhuǎn)運。RT-qPCR分析表明Cd²⁺誘導(dǎo)GhHMA1和GhHMA5的上調(diào)在很大程度上取決于GhMYB44和KO-bHLH12的存在和功能。

為進一步探究GhHMA1和GhHMA5在Cd²⁺耐受機制中的生物功能，作者采用VIGS技術(shù)沉默棉花中的GhHMA1和GhHMA5基因，生成沉默品系，Cd²⁺處理后，沉默品系對Cd²⁺表現(xiàn)出更高的敏感性。結(jié)果表明GhMYB44-GhHMA1/5信號級聯(lián)反應(yīng)正向調(diào)控棉花的Cd²⁺耐受性。

8.GhMYB44和GhPYL8協(xié)同調(diào)節(jié)ABA介導(dǎo)的Cd²⁺耐受性

為研究GhMYB44是否與ABA受體相互作用介導(dǎo)Cd²⁺耐受性，作者進行Y2H測定發(fā)現(xiàn)GhMYB44與ABA受體GhPYL8相互作用。隨后通過BiFC和蛋白pull-down實驗驗證了這一結(jié)果。為研究GhPYL8的生理功能，作者構(gòu)建了OE-GhPYL8-1/3/6株系，Cd²⁺處理后，與WT相比，OE - GhPYL8對Cd²⁺的耐受性更高。這些結(jié)果表明GhMYB44可以與GhPYL8相互作用來調(diào)節(jié)ABA介導(dǎo)的Cd²⁺耐受性。

小結(jié)：

本研究揭示了一個調(diào)控級聯(lián)反應(yīng)，即GhRCD1–GhbHLH12–GhMYB44–GhHMA1，闡明了棉花耐Cd²⁺遺傳調(diào)控的分子機制，為棉花耐Cd²⁺優(yōu)良品種的開發(fā)奠定了基礎(chǔ)，預(yù)示著棉花植物修復(fù)的新時代。