DAP-seq助力揭示蘋(píng)果MYB54轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控細(xì)胞壁防御機(jī)制

2024年12月11日，西北農(nóng)林科技大學(xué)馬鋒旺-李超團(tuán)隊(duì)在The Plant Journal期刊（IF=6.2）發(fā)表了題為“MdMYB54 reduces disease severity caused by Fusarium solani in apple by modulating cell wall cellulose and pectate lyase-dependent defense"的研究論文，該文章借助DAP-seq技術(shù)，揭示了蘋(píng)果MYB54轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞壁纖維素和果膠裂解酶依賴(lài)的防御機(jī)制以減輕病害。

研究背景

蘋(píng)果是四大水果之一，但是蘋(píng)果種植面臨再植病 (ARD)問(wèn)題，影響植株生長(zhǎng)、果實(shí)品質(zhì)和產(chǎn)量，這主要由尖孢鐮刀菌（Fusarium solani）引起。植物進(jìn)化出復(fù)雜遺傳調(diào)控因子來(lái)抵抗生物和非生物脅迫，MYB 轉(zhuǎn)錄因子家族廣泛參與植物脅迫響應(yīng)，但在蘋(píng)果抗F. solani中的作用及機(jī)制尚不清楚。植物細(xì)胞壁是抵御病原體入侵的第一道屏障，纖維素含量增加有助于增強(qiáng)植物抗病性，果膠裂解酶可觸發(fā)細(xì)胞壁防御反應(yīng)，但 MYB 轉(zhuǎn)錄因子如何通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞壁防御反應(yīng)抵抗F. solani仍有待探索。

研究結(jié)果

前期研究結(jié)果表明，MdERF114通過(guò)調(diào)控MdPRX63的轉(zhuǎn)錄顯著增強(qiáng)了蘋(píng)果根部對(duì)尖孢鐮刀菌的抗性。作者通過(guò)Y2H（酵母雙雜交系統(tǒng)）篩到與MdERF114的互作蛋白MdMYB54，并通過(guò)pull-down、Y2H、熒光素酶互補(bǔ)（Split-LUC）實(shí)驗(yàn)證實(shí)MdMYB54與MdERF114在體外和體內(nèi)均直接相互作用。MdMYB54定位于細(xì)胞核，其啟動(dòng)子中存在多個(gè)與脅迫和激素響應(yīng)相關(guān)的順式作用元件。且受F. solani、水楊酸（SA）和茉莉酸（JA）誘導(dǎo)，在蘋(píng)果根中高表達(dá)。

圖1 MdMYB54與MdERF114相互作用

為研究MdMYB54基因在蘋(píng)果根對(duì)F. solani的作用，作者構(gòu)建了MdMYB54-OE和MdMYB54-RNAi材料。 MdMYB54-OE增強(qiáng)了蘋(píng)果根對(duì)F. solani的抗性，表現(xiàn)為植株生長(zhǎng)受抑制程度減輕、根相對(duì)電導(dǎo)率（REL）和丙二醛（MDA）含量降低、根活性提高、根部病斑數(shù)量和面積減少；RNAi株系則表現(xiàn)出相反結(jié)果。

圖2 MdMYB54正向調(diào)控蘋(píng)果植株對(duì)Fusarium solani的抗性

使用DAP-seq技術(shù)檢測(cè)MYB54在全基因組水平上的結(jié)合位點(diǎn)。22%的結(jié)合位點(diǎn)位于基因啟動(dòng)子區(qū)，36%位于遠(yuǎn)端基因間區(qū)，10%位于基因下游區(qū)域，6%位于于外顯子區(qū)。通過(guò)Meme分析發(fā)現(xiàn)兩個(gè)高度富集的MdMYB54結(jié)合位點(diǎn)。DAP-qPCR結(jié)果顯示，MdCesA6、MdPLL8和MdPLL12的啟動(dòng)子區(qū)與對(duì)照相比，富集倍數(shù)顯著增加。KEGG通路富集分析顯示，MdMYB54靶基因參在戊糖和葡萄糖醛酸相互轉(zhuǎn)化、MAPK信號(hào)通路、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和植物-病原體相互作用通路中顯著富集。GO分析發(fā)現(xiàn)，靶基因在乙烯、水楊酸和缺水響應(yīng)等分子功能上顯著富集，說(shuō)明MdMYB54可能與脅迫響應(yīng)、植物生長(zhǎng)發(fā)育有關(guān)。

圖3 MdMYB54靶基因的鑒定

電泳遷移率測(cè)定（EMSA）和酵母單雜交（Y1H）實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，MdMYB54在體內(nèi)外直接與MdCesA6、MdPLL8和MdPLL12的啟動(dòng)子結(jié)合。雙熒光素酶（Dual-Luc）和葡萄糖醛酸酶（GUS）實(shí)驗(yàn)顯示，MdMYB54激活了這些基因的表達(dá)。

圖4 MdMYB54對(duì)MdCesA6、MdPLL8和MdPLL12的轉(zhuǎn)錄激活作用

在F. solani處理下，MdMYB54過(guò)表達(dá)根系纖維素含量和果膠裂解酶活性顯著高于野生型植株，而在MdMYB54-RNAi根系中則相反。

圖5 纖維素含量和果膠裂解酶活性的測(cè)定

為了進(jìn)一步研究MdCesA6、MdPLL8和MdPLL12在F. solani感染中的作用，作者構(gòu)建了MdCesA6-OE，MdPLL8-OE，和MdPLL12-OE材料。發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)MdCesA6、MdPLL8和MdPLL12增強(qiáng)了蘋(píng)果根對(duì)F. solani的抗性，表現(xiàn)為植株生長(zhǎng)改善、根損傷減輕、REL和MDA含量降低、根活性提高。

圖6 MdCesA6、MdPLL8和MdPLL12過(guò)表達(dá)增強(qiáng)了蘋(píng)果對(duì)F. solani的抗性

為研究MdERF114和MdMYB54的相互作用是否影響MdMYB54對(duì)MdCesA6、MdPLL8和MdPLL12的調(diào)控，作者進(jìn)行了GUS、雙熒光素酶測(cè)定實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，MdERF114和MdMYB54之間的相互作用促進(jìn)MdMYB54激活MdCesA6、MdPLL8和MdPLL12啟動(dòng)子的激活，增強(qiáng)蘋(píng)果對(duì)F. solani的抗性。

圖7 MdERF114促進(jìn)了MdMYB54與MdCesA6、MdPLL8和MdPLL12啟動(dòng)子的結(jié)合

實(shí)驗(yàn)結(jié)論

MdMYB54 是蘋(píng)果中抵抗F. solani的正調(diào)控因子，與MdERF114相互作用，通過(guò)直接結(jié)合并激活細(xì)胞壁相關(guān)基因MdCesA6、MdPLL8和MdPLL12的啟動(dòng)子，增強(qiáng)纖維素沉積和果膠裂解酶活性，提高蘋(píng)果對(duì)F. solani的抗性。研究揭示了MdMYB54在F. solani感染蘋(píng)果根中的調(diào)控機(jī)制，為理解其在緩解蘋(píng)果再植病挑戰(zhàn)中的作用提供了依據(jù)，為提高蘋(píng)果產(chǎn)量和品質(zhì)、培育優(yōu)良砧木新品種奠定了理論基礎(chǔ)。