研究背景
小麥?zhǔn)侨蚍秶鷥?nèi)消費(fèi)量最大,廣泛種植的糧食作物之一。然而由于種植品種單一、全球氣候變暖等原因，小麥條銹病、葉銹病、白粉病等葉部真菌病害在我國(guó)不同麥區(qū)均有發(fā)生，嚴(yán)重威脅我國(guó)小麥生產(chǎn)與糧食安全。SAR是植物的一種廣譜防御機(jī)制，在初次接觸病原體后被激活。盡管SAR在模式植物如擬南芥中已被廣泛研究，但在小麥和大麥等禾本科作物中的分子機(jī)制仍不明確。如何利用植物SAR過(guò)程關(guān)鍵基因提升作物抗病水平，是植物免疫學(xué)領(lǐng)域從抗病分子機(jī)制研究到關(guān)鍵基因開(kāi)發(fā)利用的重要科學(xué)問(wèn)題。
文獻(xiàn)速遞
2025年5月6日，河北農(nóng)大植物保護(hù)學(xué)院王逍冬教授團(tuán)隊(duì)在Journal of Advanced Research（IF=11.4）發(fā)表了題為Heterologous expression of the arley-specific HvbZIP87 transcription factor in wheat enhances broad-spectrum disease resistance with balanced yield的研究論文。該研究揭示了大麥轉(zhuǎn)錄因子HvbZIP87在小麥中異源表達(dá)可增強(qiáng)廣譜抗病性并平衡產(chǎn)量的分子機(jī)制，本文借助DAP-seq技術(shù)系統(tǒng)挖掘了HvbZIP87的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，鑒定出其直接結(jié)合的順式作用元件及調(diào)控的PR基因、鋅離子轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因，為小麥抗病高產(chǎn)的分子育種改良提供了重要理論依據(jù)和基因資源。
技術(shù)路線
研究結(jié)果
本研究通過(guò)對(duì)大麥轉(zhuǎn)基因系（wNPR1-OE和HvNPR1-Kd）在丁香假單胞菌DC3000觸發(fā)的SAR反應(yīng)中的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)bZIP轉(zhuǎn)錄因子基因Novel07221（HvbZIP87）在系統(tǒng)獲得抗性（SAR）過(guò)程中被誘導(dǎo)表達(dá)，且在HvNPR1沉默株系中表達(dá)顯著上調(diào)。系統(tǒng)發(fā)育分析顯示，HvbZIP87是大麥特異性基因，在禾本科其他作物中無(wú)近緣同源基因，其與小麥、水稻、玉米同源蛋白結(jié)構(gòu)差異顯著。HvbZIP87包含一個(gè)核定位信號(hào)（NLS，71-77氨基酸）和一個(gè)保守的bZIP結(jié)構(gòu)域（pfam07716，67-132氨基酸），亞細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)證實(shí)其定位于細(xì)胞核。NLS 突變后定位至細(xì)胞質(zhì)，表明NLS對(duì)核定位必需且充分。
圖1. HvbZIP87是參與SAR反應(yīng)的大麥特異性轉(zhuǎn)錄因子。
為探究HvbZIP87功能，作者構(gòu)建了過(guò)表達(dá)HvbZIP87的轉(zhuǎn)基因小麥株系HvbZIP87-OE。qRT-PCR檢測(cè)顯示，HvbZIP87表達(dá)量是內(nèi)源TaActin基因的8-12倍，而野生型中無(wú)該基因表達(dá)。在誘導(dǎo)SAR反應(yīng)的相鄰區(qū)域接種稻瘟病菌后，發(fā)現(xiàn)HvbZIP87-OE小麥病斑面積顯著變小。進(jìn)一步qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，HvbZIP87-OE小麥中致病性相關(guān)的（PR）基因表達(dá)水平高于野生型，表明該基因通過(guò)激活防御相關(guān)的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)增強(qiáng)抗性。
圖2. 外源表達(dá)HvbZIP87可提高小麥的SAR水平。
通過(guò)接種多種病原菌觀察抗病表型發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因小麥株系對(duì)條銹病、葉銹病、斑點(diǎn)枯萎病和鐮刀菌冠腐病均表現(xiàn)出顯著抗性，具體表現(xiàn)為孢子形成減少、病斑面積縮小和壞死程度減輕。農(nóng)藝性狀分析表明，HvbZIP87-OE株高、穗長(zhǎng)降低，每穗粒數(shù)減少，但種子更大更重，最終單穗粒重與野生型相當(dāng)，實(shí)現(xiàn)抗病性與產(chǎn)量的平衡。
圖3. HvbZIP87-OE轉(zhuǎn)基因小麥株系的廣譜抗病性。
圖4. HvbZIP87-OE轉(zhuǎn)基因小麥株系的農(nóng)藝性狀。
研究通過(guò)HvbZIP87-mCherry與TaNPR1-GFP融合蛋白的共定位實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，兩者在細(xì)胞核內(nèi)共定位，表明兩者可能存在互作。酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)證實(shí)HvbZIP87與TaNPR1直接互作，互作區(qū)域?yàn)門aNPR1的BTB/POZ域（1-170氨基酸）和NPR1/NIM1樣域（355-572氨基酸），且HvbZIP87的bZIP域不參與互作。進(jìn)一步利用BiFC、LCA和免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了兩者在植物體內(nèi)的物理結(jié)合，揭示了HvbZIP87與TaNPR1的互作機(jī)制。
圖5. HvbZIP87與TaNPR1在細(xì)胞核內(nèi)的物理相互作用。
為解析HvbZIP87增強(qiáng)抗性的分子機(jī)制，對(duì)誘導(dǎo)SAR反應(yīng)的轉(zhuǎn)基因及野生型小麥進(jìn)行RNA-seq分析。結(jié)果顯示，HvbZIP87-OE中約2/3的PR基因顯著上調(diào)，表明其可獨(dú)立于病原體激活SAR反應(yīng)。差異基因分析表明，“WT_AR vs WT_CK"與“OE_CK vs WT_CK"共享517個(gè)DEGs，GO和KEGG富集顯示其參與多糖結(jié)合、植物-病原體互作、Ca2?信號(hào)及ETI通路。植物激素分析發(fā)現(xiàn)，HvbZIP87抑制SA、GA的誘導(dǎo)積累，卻特異性促進(jìn)ABA積累，并影響IAA、CTK、JA等通路。
圖6. 基于轉(zhuǎn)錄組分析的HvbZIP87調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。
進(jìn)一步通過(guò)DAP-seq分析，發(fā)現(xiàn)HvbZIP87直接結(jié)合3982個(gè)基因，其啟動(dòng)子區(qū)域存在一個(gè)保守的“tgacgtcatcatg"樣順式元件，其中包括TaPR1、TaPR2、TaPR4和TaPR5等PR基因，表明HvbZIP87可直接調(diào)控這些基因表達(dá)。GO和KEGG分析顯示，這些基因富顯著集于“鋅離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)"和“C5-支鏈二元酸代謝"通路。結(jié)合RNA-seq數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)了103個(gè)上調(diào)基因和27個(gè)下調(diào)基因。這些差異表達(dá)基因再次顯示富集在“鋅離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)"通路，且部分基因與茉莉酸信號(hào)通路相關(guān)。研究揭示了HvbZIP87通過(guò)直接調(diào)控PR基因、鋅轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因及多激素通路等多途徑，協(xié)同增強(qiáng)小麥抗病性的分子網(wǎng)絡(luò)。
圖7. 小麥中HvbZIP87的調(diào)控順式作用元件及其下游靶標(biāo)。
研究利用Y2H文庫(kù)篩選了72個(gè)與HvbZIP87互作的新候選蛋白，其中核定位的TaMYC2在HvbZIP87-OE株系中表達(dá)顯著下調(diào)。Y2H和LCA實(shí)驗(yàn)證實(shí)HvbZIP87與TaMYC2直接互作，而TaMYC2與TaNPR1無(wú)互作。通過(guò)VIGS沉默TaMYC2后，小麥對(duì)條銹病的抗性顯著增強(qiáng)，表現(xiàn)為孢子形成減少、病斑癥狀減輕，證實(shí)TaMYC2是植物防御的負(fù)調(diào)控因子。
圖8. HvbZIP87與植物防御調(diào)節(jié)因子TaMYC2的相互作用。
本研究揭示了HvbZIP87調(diào)控小麥防御反應(yīng)的機(jī)制，為提升小麥對(duì)多種病害的遺傳抗性提供了新途徑。
圖9. HvbZIP87調(diào)控小麥防御反應(yīng)的分子機(jī)制。
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