研究背景
紫花苜蓿（Medicago sativa L.）作為全球重要的優質牧草之一，其雜交育種對提升產量和品質至關重要。然而，作為異花授粉的異源四倍體作物，苜蓿的基因組復雜性使其雄性不育的分子機制長期成謎。花藥發育作為植物生殖的核心過程，涉及絨氈層分化、花粉壁形成等精密環節，而MYB家族轉錄因子在擬南芥等模式植物中已被證實為關鍵調控因子，但在苜蓿中仍未得到充分研究。
文獻解讀
2025年3月17日，吉林農業大學徐博教授團隊在Plant Journal發表了題為“Anther-specific expression of MsMYB35 transcription factor in alfalfa (Medicago sativa L.) and its crucial role in pollen development"的研究論文。該研究聚焦紫花苜蓿中MsMYB35基因，借助DAP-seq技術在全基因組范圍內鎖定其結合位點，揭示了該基因通過茉莉酸信號通路和細胞壁重塑通路調控花藥發育的分子機制，為解析苜蓿花藥發育的調控機制及分子育種提供理論依據。
技術路線
研究結果
研究發現，紫花苜蓿MsMYB35基因在花藥中表達量顯著高于根、莖、葉，且在雄性不育系MSJN1A的小孢子母細胞和四分體時期表達量低于保持系MSJN1B。原位雜交顯示，該基因轉錄本從小孢子母細胞期至成熟花粉期存在于小孢子與絨氈層細胞，推測在花藥發育早期（尤其四分體時期）起重要作用。MsMYB35屬于R2R3-MYB轉錄因子家族，其N端含經典R2R3結構域。系統發育分析顯示，MsMYB35與蒺藜苜蓿（MtMYB35）、大豆（GmMYB35）等物種的同源蛋白進化關系密切，功能保守，可能參與花藥發育和花粉形成。亞細胞定位顯示其定位于細胞質和細胞核（以核膜為主），表明其可能通過調控核內轉錄及胞質過程參與花藥發育調控。
圖1. MsMYB35基因表達分析。
圖2. 紫花苜蓿MsMYB35的氨基酸序列比對與系統發育分析。
圖3. MsMYB35亞細胞定位分析。
為研究MsMYB35轉錄調控機制，作者通過DAP-seq鑒定出MsMYB35在基因組中的14,992個結合峰，其中8,097個高可靠性位點主要分布于基因間區（62.7%）和啟動子區（16.6%），富集到AAAAA、TAAC、GA(A/G)三類保守基序，對應3,647個靶基因。GO富集分析顯示，這些基因富集于“植物激素信號轉導"、“花發育調控"等生物過程。結合RNA-seq數據，篩選出467個直接調控基因（261個正調控、207個負調控）。KEGG富集分析顯示，其顯著富集于苯丙烷代謝、茉莉酸（JA）合成、細胞壁重塑（如果膠裂解酶通路）等與花藥發育密切相關的代謝途徑。進一步通過酵母單雜交（Y1H）和雙熒光素酶報告實驗證實MsMYB35可直接結合MsJMT和MsPL的啟動子并激活其轉錄，表明其通過調控JA甲基轉移酶和果膠酸裂解酶影響花藥發育。外源MeJA處理實驗表明，不育系花藥發育缺陷可通過MeJA處理部分恢復，證實MsMYB35-JA通路在絨氈層發育和花粉成熟中的核心作用。
圖4. 通過DAP-seq技術對MsMYB35結合位點進行的全基因組鑒定。
圖5. RNA-seq與DAP-seq數據聯合分析。
圖6. MsMYB35靶向花藥發育相關基因啟動子。
圖7. 不同發育階段花蕾中茉莉酸(JA)含量變化及對應花藥形態特征。
為進一步探究MsMYB35的功能，作者構建了MsMYB35-OE和RNAi轉基因植株。RT-PCR顯示，MsMYB35-OE株系基因表達顯著上調，RNAi株系則顯著下調。表型分析表明，過表達株系與野生型無明顯差異，而RNAi株系出現生長抑制、分枝減少、開花延遲等現象。組織學分析表明，RNAi植株在四分體階段即出現絨氈層結構不連續，單核期花粉液泡化，雙核期表皮破裂，成熟花粉無法形成。研究表明MsMYB35表達水平直接影響絨氈層發育、花粉壁形成及花藥開裂過程，其適當表達是花粉正常發育的必要條件，為解析苜蓿雄性不育機制及分子育種提供了關鍵依據。
圖8. 轉基因苜蓿與野生型植株中MsMYB35基因的表達水平。
圖9. 野生型和過表達MsMYB35紫花苜蓿不同發育階段的細胞學觀察。
圖10. 苜蓿花藥發育中MsMYB35的調控網絡模型。
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