DAP-seq技術(shù)服務常見問題解答：從樣本準備到數(shù)據(jù)分析

想做DAP-seq實驗，卻滿腦子疑問？別擔心，這篇攻略為你一次性解答所有關(guān)鍵問題，助你輕松開啟實驗之旅！

一、DAP-seq是什么？能幫我解決啥問題？

DAP-seq技術(shù)的核心原理

先在體外表達帶有特定標簽（如His、Halo標簽）的目的蛋白，讓其與標簽配體結(jié)合后，再與基因組DNA共同孵育，最后洗脫結(jié)合的DNA片段進行高通量測序和生物信息分析。

核心優(yōu)勢

它能幫你快速鎖定轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點，找到其調(diào)控的下游靶基因。更給力的是，這項技術(shù)無需特異性抗體，無需轉(zhuǎn)基因材料，即可揭示轉(zhuǎn)錄因子與DNA的互作網(wǎng)絡(luò)，如今已成為植物學、微生物學等領(lǐng)域解析基因表達調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵技術(shù)手段。

藍景科信DAP-seq技術(shù)流程

二、實驗前，我需要準備哪些材料？

（1）樣本材料

- 組織材料：植物組織5g、動物組織2g、微生物2g；或提取好的基因組DNA 10μg（可根據(jù)DNA提取效率適當調(diào)整樣本量）。

-含有轉(zhuǎn)錄因子CDS序列的質(zhì)粒：需附帶測序無誤的報告（序列準確性至關(guān)重要，否則會嚴重影響實驗周期）。

（2）組織部位如何選取？

若蛋白表達有組織或時空特異性，優(yōu)先選擇對應時期的組織——因為我們常規(guī)DAP-seq流程采用PCR-free建庫的方式，盡可能保留DNA修飾，而這些修飾可能影響蛋白與DNA的結(jié)合。

我們已完成3000+項目，植物的根、莖、葉、果實、種子等組織均有成功提取經(jīng)驗。若提取失敗，可更換易提取的組織重試。此外，還可提供去除DNA修飾的ampDAP-seq流程。

（3）參考基因組用什么版本？

參考基因組建議優(yōu)先選擇您日常分析中常用的版本，如果后續(xù)需要將DAP-seq數(shù)據(jù)與其他實驗數(shù)據(jù)（如RNA-seq、ATAC-seq等）進行聯(lián)合分析，請務必保證所有數(shù)據(jù)使用相同版本的參考基因組，這樣才能確保分析結(jié)果的準確性和一致性。

三、測序量和重復怎么定？

（1）測序量：

- 常規(guī)推薦：基因組的3X-5X。

- 需增加測序量的情況：

  - 物種與參考基因組匹配度低，導致比對率低。

  - 根部組織微生物含量高，可能降低比對率。

（2）重復設(shè)置：

我們的標準流程包含一個input對照和兩個技術(shù)重復，無需額外設(shè)置重復，可滿足文章發(fā)表需求（目前合作項目已發(fā)表于多個層次期刊）。

小知識：input對照是什么？

Input對照是親和純化前的文庫，即基因組DNA文庫，作用是在分析時降低背景噪音。

四、特殊情況說明

（1）哪些樣品不能做？

- 無參考基因組的物種。

- 轉(zhuǎn)錄因子無法在體外表達的情況。

除上述兩種，我們會提供可行性分析報告供參考。

（2）為什么有些基因家族成功率低？

部分轉(zhuǎn)錄因子需要和其他蛋白形成復合體才能與DNA結(jié)合，這些蛋白的實驗風險比較高。

五、分析結(jié)果包含哪些內(nèi)容？

藍景科信DAP-seq的生信分析包含以下內(nèi)容：

1. 原始數(shù)據(jù)處理（去接頭、污染序列及低質(zhì)量reads）

2. 數(shù)據(jù)產(chǎn)出統(tǒng)計

3. 參考序列比對分析 

4. 測序reads富集區(qū)域掃描（peak calling）

5. Peak在基因功能元件上的分布統(tǒng)計

6. Peak序列模式發(fā)掘（motif search）

7. 已知motif注釋

8. Peak相關(guān)基因鑒定

9. Peak相關(guān)基因的GO和KEGG富集分析

10. 測序數(shù)據(jù)的可視化分析

六、DAP-seq、ChIP-seq、Cut&Tag怎么選？

選擇建議：

對于ChIP實驗，需要足夠多的蛋白，為此常常將該TF過表達，然后在特定組織部位獲得該蛋白，同時需要特異性的抗體，這兩點關(guān)系到實驗的成功與否。Cut&Tag相比ChIP-seq的優(yōu)勢是樣本投入量少，信噪比高，但是同樣需要抗體，而且對樣本的活性狀態(tài)要求很高，不兼容長期凍存樣本。如果您已有轉(zhuǎn)基因材料，且有ChIP級別抗體的話，ChIP實驗還是值得嘗試的，畢竟能夠拿到體內(nèi)結(jié)果，若難以滿足上述條件，且時間、經(jīng)費有限，建議您優(yōu)先考慮DAP-seq實驗。

七、結(jié)果如何驗證？

拿到結(jié)果之后需要挑選您感興趣的靶基因，之后就要開始驗證環(huán)節(jié)，文獻中常用的驗證實驗方法包括：ChIP-qPCR、酵母單雜交、EMSA、雙熒光素酶報告實驗，我們可提供相關(guān)技術(shù)支持。

八、有哪些成功案例？

藍景科信已完成200+物種，3000+轉(zhuǎn)錄因子的實驗，周期短，口碑好，助力客戶發(fā)表高分文章Cell，Molecular Plant，Plant Biotechnology Journal，Plant Cell，PNAS，Plant Communications，Journal of Integrative Plant Biology，New Phytologist，International Journal of Biological Macromolecules，Horticulture Research，Plant Physiology等。

已做物種：