葡萄（Vitis spp.）是一種在全球范圍內廣泛種植的重要經濟型作物。目前，大多數栽培葡萄屬于歐亞種葡萄（Vitis vinifera），該品種對白粉病高度敏感。白粉病可侵染葡萄所有綠色器官，并在整個生長季持續危害，嚴重降低果實產量和品質。目前主要依賴化學殺菌劑進行防治，成本高昂且會給社會經濟和環境帶來負面影響。因此，培育抗病品種是一種更可持續的解決方案。鑒定白粉病抗性基因至關重要，可為通過基因工程手段培育抗病品種提供關鍵靶點。
2025年6月18日，西北農林科技大學園藝學院王西平教授課題組在Plant Biotechnology Journa（IF=10.5）發表了題為“A module with multiple transcription factors positively regulates powdery mildew resistance in grapevine"的研究論文。該研究借助DAP-seq技術揭示了中國野生毛葡萄通過VqLIMYB-VqWRKY46/VqNF-YC9-VqDSC1信號模塊調控白粉病抗性的分子機制，為葡萄抗病分子育種提供了新的理論基礎。
技術路線
研究發現，VqWRKY46是葡萄白粉病正調控因子，借助農桿菌介導的體細胞胚轉基因體系，成功獲得VqWRKY46過表達株系和干擾株系。接種葡萄白粉菌9 d后，與野生型（WT）相比，過表達植株表現出分生孢子數量減少、菌絲長度縮短，同時伴隨胼胝質積累增加、過氧化氫含量升高及HR反應增強等現象，以及防御相關基因的表達水平顯著上調；而干擾植株的表型則呈現相反趨勢。上述結果證實，VqWRKY46正向調控葡萄對白粉菌的抗性。
圖1. VqWRKY46增強葡萄對白粉病的抗性。
為探究VqWRKY46的上游調控機制，該研究通過酵母單雜交（Y1H）文庫篩選，鑒定到轉錄因子VqLIMYB。生物信息學分析顯示，VqWRKY46啟動子區域存在MYB家族轉錄因子的典型結合基序（Myb motif: CAGTTA）。Y1H試驗證實，VqLIMYB可特異性結合該啟動子區域。進一步的凝膠遷移實驗（EMSA）表明，VqLIMYB與Myb motif元件的直接互作具有序列特異性。雙熒光素酶報告系統（DLR）及GUS活性檢測結果顯示，VqLIMYB可顯著增強VqWRKY46啟動子的轉錄活性。上述結果表明，VqLIMYB通過直接結合VqWRKY46啟動子上的Myb motif元件，激活其表達。通過瞬時轉化技術獲得VqLIMYB過表達和缺失轉基因植株（OE-VqLIMYB、RNAi-VqLIMYB），接種白粉菌后的表型分析顯示，VqLIMYB過表達顯著增強葡萄對白粉病的抗性。
圖2. VqLIMYB直接與VqWRKY46啟動子的Myb motif（CAGTTA）結合并激活其表達。
為解析VqWRKY46的互作蛋白網絡，利用酵母雙雜交（Y2H）文庫篩選獲得轉錄因子VqNF-YC9。通過Y2H驗證、雙分子熒光互補（BiFC）、分裂熒光素酶互補（Split-LUC）、Pull-down及熒光共振能量轉移（FRET-AB）等試驗，證實VqWRKY46與VqNF-YC9存在直接互作。此外還發現，VqWRKY46與VqNF-YC9均可通過自身互作形成同源二聚體。
圖3. VqWRKY46與VqNF-YC9存在物理相互作用。
進一步研究表明，VqNF-YC9啟動子區域含有3種典型的WRKY結合基序W-box（Wbox1: TTGACC；Wbox2: TTGACT；Wbox3: TTGACA）。通過Y1H、EMSA及DLR試驗，證實VqWRKY46可直接結合上述W-box元件并激活VqNF-YC9的轉錄。實時熒光定量PCR（RT-qPCR）分析顯示，VqNF-YC9在VqWRKY46過表達株系中的表達量顯著高于野生型（WT），而在干擾株系中表達量則呈下調趨勢。上述結果表明，VqWRKY46與VqNF-YC9之間存在雙重調控關系：既能通過蛋白互作形成功能復合體，又能通過靶向啟動子W-box元件調控VqNF-YC9的轉錄表達，進而構成多層次協同調控網絡。通過瞬時轉化獲得VqNF-YC9過表達和缺失轉基因植株（OE-VqNF-YC9、RNAi-VqNF-YC9），接種白粉菌后的表型分析表明，VqNF-YC9過表達可顯著增強葡萄對白粉病的抗性。
圖4. VqWRKY46特異性結合VqNFYC9啟動子中的三個典型的W-box。
為深入鑒定VqWRKY46的直接靶基因，作者采用DNA親和純化測序技術（DAP-seq）進行分析，共鑒定到416個重疊結合峰，其中約28%定位于啟動子區域。基序富集分析顯示，核心順式元件為典型W-box（TTGACC/T）。重點關注到抗病基因VqDSC1，其啟動子區域含有3個Wbox1（TTGACC）和4個NF-YC類轉錄因子結合位點CCAAT。通過Y1H、EMSA及DLR實驗，證實VqWRKY46可特異性結合Wbox1并激活VqDSC1轉錄；而VqNF-YC9雖無法直接結合CCAAT位點，但與VqWRKY46互作后可顯著增強其對VqDSC1啟動子的激活作用。RT-qPCR結果顯示，VqDSC1在VqWRKY46過表達株系中顯著上調，在干擾株系中顯著下調，且其表達受白粉菌誘導顯著增強。功能驗證表明，瞬時過表達VqDSC1（OE-VqDSC1）可誘導超敏反應（HR）并增強葡萄白粉病抗性，而干擾株系（RNAi-VqDSC1）則表現出感病表型。
圖5. 使用DNA親和純化和測序（DAP Seq）技術檢測VqWRKY46在全基因組范圍內的結合序列和靶基因。
綜上，該研究揭示VqWRKY46與VqNF-YC9通過形成同源二聚體及蛋白復合體的雙重機制，協同調控VqDSC1的表達，進而介導葡萄白粉病抗性。研究最終闡明了VqLIMYB-VqWRKY46/VqNF-YC9-VqDSC1信號模塊的抗病調控網絡，為葡萄抗病分子育種提供了關鍵基因靶點及理論支撐。
圖6. VqLIMYB-VqWRKY46/VqNF-YC9-VqDSC1正向調控葡萄白粉病抗性模型。
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