2025年6月，北京林業(yè)大學(xué)張金鳳團(tuán)隊(duì)在《New Phytologist》（IF=8.1）上發(fā)表了一篇題目為“BZR2-GRF5 acts as a hub module in regulating in vitro regeneration through brassinosteroid–auxin crosstalk in hybrid sweetgum"的研究論文，本文借助DAP-seq技術(shù)，揭示了BZR2-GRF5轉(zhuǎn)錄調(diào)控模塊通過(guò)組織特異性調(diào)控生長(zhǎng)素外排基因LsfWAG2，介導(dǎo)油菜素內(nèi)酯（BR）與生長(zhǎng)素（IAA）信號(hào)互作，雙向調(diào)控體細(xì)胞胚胎發(fā)生（SE）與器官再生的分子機(jī)制，為木本植物再生機(jī)制研究與遺傳改良提供了全新視角。
研究背景
木本植物離體再生是種質(zhì)資源擴(kuò)繁、保存及遺傳改良的關(guān)鍵技術(shù)，主要通過(guò)體細(xì)胞胚胎發(fā)生（SE）和器官發(fā)生兩條途徑實(shí)現(xiàn)。楓香是重要林木資源，雜交楓香因生長(zhǎng)快、木材密度高，具有顯著優(yōu)勢(shì)，但其再生體系存在愈傷誘導(dǎo)率低、芽再生效率低等問(wèn)題。油菜素內(nèi)酯（BR）與生長(zhǎng)素是調(diào)控植物再生的關(guān)鍵激素，BZR轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)靶向生長(zhǎng)素信號(hào)組分（如PIN, ARF）影響激素合成與運(yùn)輸。此前研究發(fā)現(xiàn)外源epiBR需與生長(zhǎng)素聯(lián)用才能誘導(dǎo)雜交楓香SE，提示BZR基因可能是再生通路的關(guān)鍵調(diào)控因子，但其作用機(jī)制尚不清楚。
技術(shù)路線(xiàn)
研究結(jié)果
本研究利用Hidden Markov 模型從雜交楓香基因組中鑒定出8個(gè)BZR家族基因，組織特異性表達(dá)譜顯示LsfBZR1/2在胚性愈傷組織（EC）及胚胎發(fā)生階段特異性高表達(dá)。通過(guò)酵母雙雜交（Y2H）、熒光素酶互補(bǔ)成像（LCI）、蛋白Pull-down、亞細(xì)胞定位多種實(shí)驗(yàn)，證實(shí)LsfBZR2與生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子LsfGRF2/3/5存在直接蛋白互作，且發(fā)生在細(xì)胞核內(nèi)。其中LsfGRF5互作效應(yīng)最為顯著。GRF家族是植物生長(zhǎng)發(fā)育的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，提示LsfBZR1/2可能通過(guò)與GRF蛋白互作調(diào)控再生。
圖1 雜交楓香中LsfBZR1/2的表達(dá)模式及序列分析。
為了進(jìn)一步驗(yàn)證BZR2-GRF5模塊功能，構(gòu)建了LsfBZR2及LsfGRF5過(guò)表達(dá)株系。表型分析表明，LsfBZR2-OE、LsfGRF5-OE株系均表現(xiàn)為鮮重增加；體細(xì)胞胚胎數(shù)量減少，且異常胚胎比例顯著升高；再生芽生長(zhǎng)速率加快且形成密集芽簇。qRT-PCR顯示過(guò)表達(dá)株系基因表達(dá)顯著上調(diào)，且植株表型正常，證實(shí)該模塊對(duì)器官發(fā)生有正向調(diào)控作用。
圖2 過(guò)表達(dá)LsfBZR2促進(jìn)雜交楓香愈傷組織增殖并抑制其胚胎發(fā)生能力。
圖3 過(guò)表達(dá)LsfBZR2正向調(diào)控雜交楓香離體器官發(fā)生中的芽再生。
圖4 LsfBZR2與雜交楓香中的LsfGRF2、LsfGRF3和LsfGRF5發(fā)生互作。
圖5 LsfGRF5增強(qiáng)雜交楓香的愈傷組織增殖能力，同時(shí)抑制體細(xì)胞胚胎的形成。
圖6 過(guò)表達(dá)LsfGRF5促進(jìn)雜交楓香的芽再生。
為了鑒定LsfBZR2調(diào)控的下游基因，作者采用DNA親和純化測(cè)序（DAP-seq）技術(shù)來(lái)識(shí)別該轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的基因組DNA元件。結(jié)果顯示LsfBZR2在36,582個(gè)基因組位點(diǎn)高度富集，涵蓋8,454個(gè)基因。其中12.2%位于啟動(dòng)子區(qū)域，核心結(jié)合基序?yàn)椤瓹ACGTG’。GO富集結(jié)果表明，與LsfBZR2蛋白結(jié)合位點(diǎn)相關(guān)的基因主要富集在鋅離子穩(wěn)態(tài)維持、分生組織發(fā)育、表觀遺傳學(xué)、減數(shù)分裂、乙醛酸循環(huán)和脫落酸代謝途徑。與RNA-seq數(shù)據(jù)聯(lián)合分析篩選出457個(gè)受LsfBZR2調(diào)控的差異基因，其中生長(zhǎng)素外排載體基因LsfWAG2（Lsf07G005650）被確認(rèn)為直接靶基因。qRT-PCR與LC-MS/MS結(jié)果顯示，在SE途徑中，LsfBZR2過(guò)表達(dá)抑制LsfWAG2表達(dá)，導(dǎo)致IAA積累，促進(jìn)愈傷增殖；在器官發(fā)生途徑中，LsfBZR2激活LsfWAG2表達(dá)，加速生長(zhǎng)素外排使IAA水平降低，從而促進(jìn)芽原基形成。酵母單雜交（Y1H）與雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)（DLR）證實(shí)，LsfBZR2直接結(jié)合啟動(dòng)子區(qū)并調(diào)控其轉(zhuǎn)錄活性。
圖7 雜交楓香中LsfBZR2可結(jié)合LsfWAG2基因啟動(dòng)子以調(diào)控生長(zhǎng)素運(yùn)輸。
本研究建立了雜交楓香中BR-生長(zhǎng)素信號(hào)互作的分子調(diào)控模型：BZR2-GRF5模塊通過(guò)差異化調(diào)控LsfWAG2表達(dá)，在SE中維持高生長(zhǎng)素環(huán)境促進(jìn)愈傷增殖，在器官發(fā)生中降低生長(zhǎng)素水平以加速芽再生，形成組織特異性的雙向調(diào)控機(jī)制。這一發(fā)現(xiàn)為木本植物再生效率的遺傳改良提供了新靶點(diǎn)，并揭示了BR-生長(zhǎng)素互作在組織特異性發(fā)育中的精準(zhǔn)調(diào)控機(jī)制。
圖8 LsfBZR2-LsfGRF5模塊介導(dǎo)生長(zhǎng)素信號(hào)調(diào)控雜交楓香植株體外再生的工作模型。
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