DAP-seq技術助力揭示擬南芥根基本組織發育的調控機制

2024 年 11月 18 日，蘭州大學黎家教授團隊在《Current Biology》（IF=8.1）發表了題為“Three RLKs integrate SHR-SCR and gibberellins to regulate root ground tissue patterning in Arabidopsis thaliana"的研究論文，該研究揭示了受體激酶ARH1、FEI1和FEI2共同調控根基本組織發育的分子機制，并借助DAP-seq技術發現SHR和SCR可能通過與其他調節蛋白的相互作用來抑制這些RLK的表達。

研究背景

在擬南芥中，根部早期發育階段的基質（GT）由皮層和內皮層組成。在基質成熟過程中，內皮層偶爾會發生額外的周緣細胞分裂（PCDs），在皮層和內皮層之間形成中間皮層（MC）。已鑒定出多種調節蛋白和植物激素參與基質模式的形成，如SHORT ROOT（SHR）、SCARECROW（SCR）、CYCLIND6；1（CYCD6；1）和赤霉素（GAs）。受體樣激酶（RLKs）家族（如LRR-RLKs）在根發育中的作用也逐漸被關注，但這些因素之間的相互關系尚未闡明。

技術路線

研究結果

本研究通過遺傳篩選尋找影響皮層組織模式的突變體，并結合分子生物學、細胞生物學和生化方法驗證候選基因功能，發現ARH1、FEI1和FEI2在調控擬南芥根尖的GT模式中起著關鍵作用。

圖1 ARH1、FEI1和FEI2的三重突變體在根尖內皮組織中表現出增強的PCD。

圖2 三重突變體根尖的附加細胞層表現出MC的細胞特征。

圖3 ARH1、FEI1和FEI2主要以細胞自主的方式調節MC的形成。

研究顯示ARH1、FEI1和FEI2的轉錄水平受到SHR和SCR的負調控。作者通過BiFC檢測發現SHR和SCR并不是通過蛋白質-蛋白質相互作用直接調節RLKs的功能。隨后為進一步研究了這些RLKs的轉錄水平是否受SHR和SCR的直接調控，作者使用了Chip-seq和DAP-seq技術檢測這些轉錄因子和DNA序列之間的相互作用，結果發現這些RLKs的啟動子和兩種轉錄因子之間不存在相互作用。同時采用酵母單雜交系統和熒光素酶(LUC)報告基因系統進行了驗證，也未能檢測到三個RLKs的啟動子和兩個轉錄因子。這些結果表明，SHR和SCR可能通過一種間接的機制負調控三個RLKs的轉錄水平。

圖4 SHR和SCR負調控ARH1、FEI1和FEI2的轉錄水平。

圖S5 使用四種不同的方法檢測SHR/SCR與ARH1、FEI1和FEI2啟動子之間的潛在相互作用。

為了進一步理解ARH1、FEI1和FEI2調節GT模式的機制，作者通過外源GA和PAC（GA生物合成抑制劑）處理結合突變體分析，結果表明RLKs通過調節GAs的合成來影響根基本組織發育。同時通過共聚焦和RT-qPCR分析根尖CYCD6;1基因的表達變化，明確了CYCD6;1在根基本組織發育中的作用。以上結果，提出并證明了SHR/SCR-ARH1/FEI1/FEI2-GAs-CYCD6;1的根基本組織發育調控模塊。即在根發育早期，受體激酶通過調節GAs的合成抑制CYCD6;1在根尖內皮層中的異位表達，進而抑制中皮層形成，精確調控根基本組織的發育。

圖5 ARH1、FEI1和FEI2通過根尖GA的生物合成調節GT模式。

圖6 SHR和SCR突變體根尖中催化GA生物合成酶編碼基因的轉錄水平升高。

圖S6 抑制GA生物合成可部分挽救shr和scr中MC形成減少的表型。

綜上所述，該研究明確了ARH1、FEI1和FEI2三個受體激酶在整合SHR-SCR信號通路和GA信號來調控根基本組織模式中的關鍵作用，揭示了根基本組織發育的分子調控機制。