微生物鑒定與微生物多樣性測序結(jié)合解析復(fù)雜樣本中的稀有菌群
更新時(shí)間：2026-01-30 點(diǎn)擊次數(shù)：64次
在現(xiàn)代微生物學(xué)研究中，復(fù)雜環(huán)境樣本（如土壤、腸道內(nèi)容物、海洋沉積物或臨床標(biāo)本）中往往包含成百上千種微生物，其中絕大多數(shù)為豐度極低的“稀有菌群”（rare biosphere）。這些稀有菌群雖占比微小，卻可能在生態(tài)系統(tǒng)功能維持、宿主健康調(diào)控甚至疾病發(fā)生中扮演關(guān)鍵角色。然而，傳統(tǒng)培養(yǎng)方法對大多數(shù)不可培養(yǎng)微生物束手無策，而單一的高通量測序技術(shù)又難以準(zhǔn)確鑒定低豐度物種。因此，將經(jīng)典微生物鑒定手段與新一代微生物多樣性測序技術(shù)有機(jī)結(jié)合，成為深入解析復(fù)雜樣本中稀有菌群結(jié)構(gòu)與功能的有效策略。
一、稀有菌群的研究價(jià)值與挑戰(zhàn)
稀有菌群通常指在微生物群落中相對豐度低于0.1%甚至更低的類群。盡管其數(shù)量稀少，但研究表明，它們具有高度的系統(tǒng)發(fā)育多樣性，是微生物“種子庫”的重要組成部分。在環(huán)境擾動(dòng)（如抗生素使用、氣候變化或污染事件）后，部分稀有菌可能迅速增殖，成為優(yōu)勢種群，從而重塑整個(gè)微生物生態(tài)網(wǎng)絡(luò)。此外，在人體腸道中，某些稀有致病菌或條件致病菌在特定條件下可引發(fā)感染或慢性炎癥，因此對其精準(zhǔn)識別具有重要的臨床意義。
然而，稀有菌群的檢測面臨多重挑戰(zhàn)：首先，高通量測序（如16S rRNA基因擴(kuò)增子測序）雖然能提供群落整體結(jié)構(gòu)信息，但在低豐度區(qū)域易受PCR擴(kuò)增偏差、測序錯(cuò)誤及數(shù)據(jù)庫不完整等因素干擾，導(dǎo)致假陽性或假陰性；其次，宏基因組測序雖可繞過擴(kuò)增步驟，但對稀有物種的覆蓋深度不足，難以實(shí)現(xiàn)可靠組裝和注釋；再者，缺乏有效的富集或分離手段，使得稀有菌難以被單獨(dú)研究其生理特性。
二、微生物鑒定與多樣性測序的互補(bǔ)優(yōu)勢
傳統(tǒng)微生物鑒定方法，包括形態(tài)學(xué)觀察、生化試驗(yàn)、質(zhì)譜分析（如MALDI-TOF MS）以及特異性PCR等，雖通量較低，但具有高特異性和準(zhǔn)確性，尤其適用于已知目標(biāo)菌的確認(rèn)。而高通量多樣性測序則擅長全景式描繪群落組成，揭示未知類群的存在。兩者結(jié)合，可形成“廣篩+精鑒”的研究范式。
例如，在初步通過16S rRNA擴(kuò)增子測序發(fā)現(xiàn)某臨床樣本中存在潛在致病稀有菌（Elizabethkingia屬）后，可設(shè)計(jì)特異性引物進(jìn)行qPCR定量，并結(jié)合培養(yǎng)富集與MALDI-TOF MS驗(yàn)證其存在與活性。這種策略不僅提高了鑒定的可信度，還能排除測序背景噪音的干擾。
更進(jìn)一步，近年來發(fā)展的靶向富集測序（如基于探針捕獲的16S或全基因組富集）技術(shù)，可在測序前對目標(biāo)稀有菌DNA進(jìn)行富集，顯著提升其在測序數(shù)據(jù)中的比例，從而提高檢測靈敏度。在此基礎(chǔ)上，結(jié)合單細(xì)胞分選與全基因組擴(kuò)增（scWGA），甚至可對無法培養(yǎng)的稀有菌進(jìn)行基因組水平的解析。
三、整合策略的實(shí)際應(yīng)用案例
在一項(xiàng)關(guān)于早產(chǎn)兒腸道菌群的研究中，研究者首先利用16S rRNA測序發(fā)現(xiàn)多個(gè)低豐度Clostridioides difficile信號，但無法確定是否為活菌或污染。隨后，他們采用厭氧培養(yǎng)結(jié)合特異性毒素基因PCR，成功分離出活的產(chǎn)毒菌株，并通過全基因組測序確認(rèn)其毒力基因型。這一整合方法不僅證實(shí)了稀有致病菌的存在，還揭示了其潛在致病風(fēng)險(xiǎn)，為臨床干預(yù)提供了依據(jù)。
另一項(xiàng)海洋微生物研究則采用宏基因組測序結(jié)合熒光原位雜交（FISH）技術(shù)，對深海沉積物中豐度極低的古菌類群進(jìn)行可視化定位與功能注釋。通過設(shè)計(jì)針對特定16S序列的FISH探針，研究者在顯微鏡下直接觀察到這些稀有古菌的空間分布，并結(jié)合宏基因組binning重建其代謝通路，揭示其在氮循環(huán)中的潛在作用。
四、未來展望
隨著長讀長測序、單細(xì)胞多組學(xué)及人工智能輔助分類算法的發(fā)展，微生物鑒定與微生物多樣性測序的融合將更加緊密。未來的研究可構(gòu)建“從群落到單細(xì)胞再到功能驗(yàn)證”的完整鏈條，實(shí)現(xiàn)對稀有菌群從存在性確認(rèn)到生態(tài)功能解析的全鏈條研究。 面對復(fù)雜樣本中稀有菌群這一“暗物質(zhì)”，唯有打破技術(shù)壁壘，整合多維度方法，才能真正揭開其神秘面紗，為環(huán)境微生物學(xué)、醫(yī)學(xué)微生物學(xué)及合成生物學(xué)等領(lǐng)域提供新的認(rèn)知基礎(chǔ)與應(yīng)用潛力。
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